Væskekromatografi er hovedmetoden til at teste indholdet af hver komponent og urenheder i råvarer, mellemprodukter, præparater og emballagematerialer, men mange stoffer har ikke standardmetoder at stole på, så det er uundgåeligt at udvikle nye metoder. I udviklingen af væskefasemetoder er den kromatografiske søjle kernen i væskekromatografi, så det er afgørende, hvordan man vælger en passende kromatografisøjle. I denne artikel vil forfatteren forklare, hvordan man vælger en væskekromatografisøjle ud fra tre aspekter: overordnede ideer, overvejelser og anvendelsesområde.
A. Overordnede ideer til udvælgelse af væskekromatografisøjler
1. Vurder analyttens fysiske og kemiske egenskaber: såsom kemisk struktur, opløselighed, stabilitet (såsom om det er let at blive oxideret/reduceret/hydrolyseret), surhed og alkalinitet osv., især den kemiske struktur er nøglen faktor ved bestemmelse af egenskaberne, såsom den konjugerede gruppe har stærk ultraviolet absorption og stærk fluorescens;
2. Bestem formålet med analysen: om høj separation, høj kolonneeffektivitet, kort analysetid, høj følsomhed, højtryksmodstand, lang kolonnelevetid, lave omkostninger osv. er påkrævet;
- Vælg en passende kromatografisk kolonne: forstå sammensætningen, fysiske og kemiske egenskaber af det kromatografiske fyldstof, såsom partikelstørrelse, porestørrelse, temperaturtolerance, pH-tolerance, adsorption af analytten osv.
- Overvejelser for udvælgelse af væskekromatografisøjler
Dette kapitel vil diskutere de faktorer, der skal tages i betragtning, når man vælger en kromatografisøjle ud fra perspektivet af de fysiske og kemiske egenskaber af selve kromatografisøjlen. 2.1 Fyldstofmatrix
2.1.1 Silicagelmatrix Fyldstofmatrixen i de fleste væskekromatografisøjler er silicagel. Denne type fyldstof har høj renhed, lav pris, høj mekanisk styrke og er let at modificere grupper (såsom phenylbinding, aminobinding, cyanobinding osv.), men pH-værdien og temperaturområdet, det tolererer, er begrænset: pH-området for de fleste silicagelmatrixfyldstoffer er 2 til 8, men pH-området for specielt modificerede silicagelbundne faser kan være så bredt som 1,5 til 10, og der er også specielt modificerede silicagelbundne faser, der er stabile ved lav pH, såsom Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, som er stabil ved pH 1 til 8; den øvre temperaturgrænse for silicagelmatrixen er normalt 60 ℃, og nogle kromatografisøjler kan tolerere en temperatur på 40 ℃ ved høj pH.
2.1.2 Polymermatrix Polymerfyldstoffer er for det meste polystyren-divinylbenzen eller polymethacrylat. Deres fordele er, at de kan tåle et bredt pH-område – de kan bruges i området fra 1 til 14, og de er mere modstandsdygtige over for høje temperaturer (kan nå over 80 °C). Sammenlignet med silica-baserede C18-fyldstoffer har denne type fyldstof stærkere hydrofobicitet, og den makroporøse polymer er meget effektiv til at adskille prøver såsom proteiner. Dens ulemper er, at kolonneeffektiviteten er lavere, og den mekaniske styrke er svagere end for silicabaserede fyldstoffer. 2.2 Partikelform
De fleste moderne HPLC-fyldstoffer er sfæriske partikler, men nogle gange er de uregelmæssige partikler. Sfæriske partikler kan give lavere kolonnetryk, højere kolonneeffektivitet, stabilitet og længere levetid; ved brug af højviskose mobile faser (såsom fosforsyre) eller når prøveopløsningen er tyktflydende, har uregelmæssige partikler et større specifikt overfladeareal, hvilket er mere befordrende for den fulde virkning af de to faser, og prisen er relativt lav. 2.3 Partikelstørrelse
Jo mindre partikelstørrelsen er, jo højere er kolonneeffektiviteten og jo højere adskillelse, men jo dårligere er højtryksmodstanden. Den mest almindeligt anvendte søjle er søjlen med 5 μm partikelstørrelse; hvis separationskravet er højt, kan der vælges et 1,5-3 μm fyldstof, hvilket er befordrende for at løse separationsproblemet for nogle komplekse matrix- og flerkomponentprøver. UPLC kan bruge 1,5 μm fyldstoffer; Fyldstoffer på 10 μm eller større partikelstørrelser bruges ofte til semi-præparative eller præparative kolonner. 2.4 Kulstofindhold
Kulstofindhold refererer til andelen af bundet fase på overfladen af silicagel, som er relateret til specifikt overfladeareal og bundet fasedækning. Højt kulstofindhold giver høj kolonnekapacitet og høj opløsning og bruges ofte til komplekse prøver, der kræver høj adskillelse, men på grund af den lange interaktionstid mellem de to faser er analysetiden lang; kromatografiske søjler med lavt kulstofindhold har en kortere analysetid og kan vise forskellige selektiviteter og bruges ofte til simple prøver, der kræver hurtig analyse, og prøver, der kræver høje vandfasebetingelser. Generelt varierer kulstofindholdet i C18 fra 7% til 19%. 2.5 Porestørrelse og specifikt overfladeareal
HPLC-adsorptionsmedier er porøse partikler, og de fleste interaktioner finder sted i porerne. Derfor skal molekyler ind i porerne for at blive adsorberet og adskilt.
Porestørrelse og specifikt overfladeareal er to komplementære begreber. Lille porestørrelse betyder stort specifikt overfladeareal og omvendt. Et stort specifikt overfladeareal kan øge interaktionen mellem prøvemolekyler og bundne faser, forbedre retention, øge prøvebelastning og søjlekapacitet og adskillelse af komplekse komponenter. Fuldt porøse fyldstoffer hører til denne type fyldstoffer. For dem med høje separationskrav anbefales det at vælge fyldstoffer med stort specifikt overfladeareal; lille specifik overflade kan reducere modtrykket, forbedre kolonneeffektiviteten og reducere ligevægtstiden, hvilket er velegnet til gradientanalyse. Kerne-skal fyldstoffer hører til denne type fyldstoffer. Ud fra den forudsætning at sikre adskillelse anbefales det at vælge fyldstoffer med lille specifikt overfladeareal til dem med høje krav til analyseeffektivitet. 2.6 Porevolumen og mekanisk styrke
Porevolumen, også kendt som "porevolumen", refererer til størrelsen af hulrumsvolumenet pr. enhedspartikel. Det kan godt afspejle fyldstoffets mekaniske styrke. Den mekaniske styrke af fyldstoffer med stort porevolumen er lidt svagere end fyldstoffer med lille porevolumen. Fyldstoffer med porevolumen mindre end eller lig med 1,5 mL/g anvendes mest til HPLC-separation, mens fyldstoffer med porevolumen større end 1,5 mL/g hovedsageligt anvendes til molekylær eksklusionskromatografi og lavtrykschromatografi. 2.7 Afdækningsgrad
Afdækning kan reducere haletoppe forårsaget af interaktionen mellem forbindelser og udsatte silanolgrupper (såsom ionbinding mellem alkaliske forbindelser og silanolgrupper, van der Waals-kræfter og hydrogenbindinger mellem sure forbindelser og silanolgrupper), og derved forbedre søjleeffektiviteten og topformen . Uafsluttede bundne faser vil producere forskellige selektiviteter i forhold til lukkede bundne faser, især for polære prøver.
- Anvendelsesområde for forskellige væskekromatografikolonner
Dette kapitel vil beskrive anvendelsesomfanget af forskellige typer væskekromatografikolonner gennem nogle tilfælde.
3.1 Omvendt fase C18 kromatografisøjle
C18-søjlen er den mest anvendte omvendt-fase-søjle, som kan opfylde indholds- og urenhedstestene for de fleste organiske stoffer, og er anvendelig til mellempolære, svagt polære og ikke-polære stoffer. Type og specifikation af C18-kromatografisk kolonne bør vælges i henhold til de specifikke separationskrav. For stoffer med høje separationskrav anvendes f.eks. ofte 5 μm*4,6 mm*250 mm specifikationer; for stoffer med komplekse separationsmatricer og lignende polaritet kan der anvendes 4 μm*4,6 mm*250 mm specifikationer eller mindre partikelstørrelser. For eksempel brugte forfatteren en 3 μm * 4,6 mm * 250 mm kolonne til at påvise to genotoksiske urenheder i celecoxib API. Adskillelsen af de to stoffer kan nå op på 2,9, hvilket er fremragende. Derudover, under forudsætning af at sikre adskillelse, hvis hurtig analyse er påkrævet, vælges ofte en kort søjle på 10 mm eller 15 mm. For eksempel, når forfatteren brugte LC-MS/MS til at påvise en genotoksisk urenhed i piperaquinphosphat API, blev der brugt en 3 μm*2,1 mm*100 mm søjle. Adskillelsen mellem urenheden og hovedkomponenten var 2,0, og påvisningen af en prøve kan fuldføres på 5 minutter. 3.2 Omvendt fase phenylsøjle
Phenyl kolonne er også en type omvendt fase kolonne. Denne type søjle har stærk selektivitet for aromatiske forbindelser. Hvis reaktionen af aromatiske forbindelser målt ved almindelig C18 kolonne er svag, kan du overveje at erstatte phenyl kolonnen. For eksempel, da jeg lavede celecoxib API, var hovedkomponentresponsen målt ved phenylsøjlen fra den samme producent og den samme specifikation (alle 5 μm*4,6 mm*250 mm) omkring 7 gange den for C18-kolonnen. 3.3 Normalfasesøjle
Som et effektivt supplement til omvendt fase søjle er normalfase søjle velegnet til meget polære forbindelser. Hvis toppen stadig er meget hurtig, når der elueres med mere end 90 % vandig fase i omvendt-fase-kolonnen, og endda tæt på og overlapper med opløsningsmiddel-toppen, kan du overveje at udskifte normal-fase kolonnen. Denne type søjle inkluderer hilic søjle, amino søjle, cyano søjle osv.
3.3.1 Hilic søjle Hilic søjle indlejrer sædvanligvis hydrofile grupper i den bundne alkylkæde for at øge responsen på polære stoffer. Denne type søjle er velegnet til analyse af sukkerstoffer. Forfatteren brugte denne type kolonne, når han lavede indholdet og relaterede stoffer af xylose og dets derivater. Isomererne af et xylosederivat kan også være godt adskilte;
3.3.2 Aminosøjle og cyanosøjle Aminosøjle og cyanosøjle henviser til introduktionen af amino- og cyanomodifikationer i slutningen af henholdsvis den bundne alkylkæde for at forbedre selektiviteten for specielle stoffer: for eksempel er aminosøjle et godt valg til adskillelse af sukkerarter, aminosyrer, baser og amider; cyanosøjle har bedre selektivitet ved adskillelse af hydrogenerede og uhydrogenerede strukturelle lignende stoffer på grund af tilstedeværelsen af konjugerede bindinger. Aminosøjle og cyanosøjle kan ofte skiftes mellem normal fasesøjle og omvendt fasesøjle, men hyppig skift anbefales ikke. 3.4 Chiral søjle
Chiral søjle, som navnet antyder, er velegnet til adskillelse og analyse af chirale forbindelser, især inden for lægemidler. Denne type søjle kan overvejes, når konventionelle omvendt fase og normal fase søjler ikke kan opnå adskillelse af isomerer. For eksempel brugte forfatteren en 5 μm*4,6 mm*250 mm chiral søjle til at adskille de to isomerer af 1,2-diphenylethylendiamin: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylendiamin og (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylendiamin, og adskillelsen mellem de to nåede ca. 2,0. Chirale søjler er dog dyrere end andre typer søjler, normalt 1W+/stk. Hvis der er behov for sådanne kolonner, skal enheden lave et tilstrækkeligt budget. 3.5 Ionbyttersøjle
Ionbytterkolonner er velegnede til adskillelse og analyse af ladede ioner, såsom ioner, proteiner, nukleinsyrer og nogle sukkerstoffer. Ifølge fyldstoftypen er de opdelt i kationbytterkolonner, anionbytterkolonner og stærke kationbytterkolonner.
Kationbytterkolonner omfatter calciumbaserede og hydrogenbaserede søjler, som hovedsageligt er egnede til analyse af kationiske stoffer såsom aminosyrer. For eksempel brugte forfatteren calciumbaserede kolonner, når han analyserede calciumgluconat og calciumacetat i en skylleopløsning. Begge stoffer havde stærke responser ved λ=210nm, og separationsgraden nåede 3,0; forfatteren brugte brint-baserede kolonner, når han analyserede glukose-relaterede stoffer. Flere større beslægtede stoffer – maltose, maltotriose og fructose – havde høj følsomhed under differentialdetektorer med en detektionsgrænse så lav som 0,5 ppm og en separationsgrad på 2,0-2,5.
Anionbytterkolonner er hovedsageligt velegnede til analyse af anioniske stoffer såsom organiske syrer og halogenioner; stærke kationbytterkolonner har højere ionbytterkapacitet og selektivitet og er velegnede til adskillelse og analyse af komplekse prøver.
Ovenstående er blot en introduktion til typerne og anvendelsesområderne for flere almindelige væskekromatografikolonner kombineret med forfatterens egen erfaring. Der er andre specielle typer kromatografiske søjler i faktiske applikationer, såsom kromatografiske søjler med stor pore, kromatografi med små porer, affinitetskromatografisøjler, multimode kromatografisøjler, ultrahøjtydende væskekromatografisøjler (UHPLC), søjler med superkritisk væskekromatografi ( SFC), osv. De spiller en vigtig rolle på forskellige områder. Den specifikke type kromatografisk kolonne bør vælges i henhold til prøvens struktur og egenskaber, separationskrav og andre formål.
Indlægstid: 14-jun-2024