Principper og metoder til kvantitativ analyse ved væskekromatografi

Separationsmekanismen for væskekromatografi er baseret på forskellen i affiniteten af ​​komponenterne i blandingen for de to faser.

Ifølge de forskellige stationære faser er væskekromatografi opdelt i væske-faststofkromatografi, væske-væskekromatografi og bundet fasekromatografi.De mest anvendte er væske-faststofkromatografi med silicagel som fyldstof og bundet fasekromatografi med mikrosilica som matrix.

Ifølge formen af ​​stationær fase kan væskekromatografi opdeles i søjlekromatografi, papirkromatografi og tyndtlagskromatografi.I henhold til adsorptionskapaciteten kan den opdeles i adsorptionskromatografi, partitionskromatografi, ionbytterkromatografi og gelpermeationskromatografi.

I de senere år er et højtryksvæskestrømningssystem blevet tilføjet til væskesøjlekromatografisystemet for at få mobilfasen til at flyde hurtigt under højt tryk for at forbedre separationseffekten, så højeffektiv (også kendt som højtryks) væskekromatografi er opstået.

EN DEL
01 Princip for kvantitativ analyse af væskekromatografi

For at kvantificere på baggrund af kvalitative kræves rene stoffer som standarder;

Kvantificering af væskekromatografi er en relativt kvantitativ metode: det vil sige, at mængden af ​​analytten i blandingen estimeres ud fra en kendt mængde ren standardprøve

EN DEL
02 Grundlag for kvantificering ved væskekromatografi

Mængden af ​​den målte komponent (W) er proportional med responsværdien (A) (spidshøjde eller spidsareal), W=f×A.

Kvantitativ korrektionsfaktor (f): Det er proportionalitetskonstanten for den kvantitative beregningsformel, og dens fysiske betydning er mængden af ​​den målte komponent repræsenteret af enhedsresponsværdien (spidsareal).

Den kvantitative korrektionsfaktor kan opnås fra den kendte mængde standardprøve og dens responsværdi.

Mål responsværdien af ​​den ukendte komponent, og mængden af ​​komponenten kan opnås ved den kvantitative korrektionsfaktor.

EN DEL
03 Fælles udtryk i kvantitativ analyse

Prøve (prøve): en opløsning indeholdende en analyt til kromatografisk analyse.Opdelt i standard og ukendte prøver.

Standard: Et rent produkt med en kendt koncentration.Ukendt prøve (ukendt): Den blanding, hvis koncentration skal testes.

Prøvevægt: Den oprindelige vejning af prøven, der skal testes.

Fortynding: Fortyndingsfaktoren for den ukendte prøve.

Komponent: den kromatografiske top, der skal analyseres kvantitativt, dvs. analytten, hvis indhold er ukendt.

Mængde af komponent (mængde): indholdet (eller koncentrationen) af det stof, der skal testes.

Integeritet: Den beregningsmæssige proces med at måle toparealet af en kromatografisk top med en computer.

Kalibreringskurve: En lineær kurve over komponentindhold versus responsværdi, etableret ud fra en kendt mængde standardstof, der bruges til at bestemme det ukendte indhold af analytten.

EN DEL
04 Kvantitativ analyse af væskekromatografi

1. Vælg en kromatografisk metode, der er egnet til kvantitativ analyse:

l Bekræft toppen af ​​den detekterede komponent og opnå en opløsning (R) større end 1,5

l Bestem konsistensen (renheden) af de kromatografiske toppe af de testede komponenter

l Bestem metodens detektionsgrænse og kvantificeringsgrænse;følsomhed og lineært område

2. Etabler en kalibreringskurve med standardprøver af forskellige koncentrationer

3. Kontroller nøjagtigheden og præcisionen af ​​kvantitative metoder

4. Brug den tilsvarende kromatografistyringssoftware til at implementere prøveindsamling, databehandling og rapportering af resultater

EN DEL
05 Identifikation af kvantitative toppe (kvalitativ)

Identificer kvalitativt hver kromatografisk top, der skal kvantificeres

Brug først standardprøven til at bestemme retentionstiden (Rt) for den kromatografiske top, der skal kvantificeres.Ved at sammenligne retentionstiden, find den komponent, der svarer til hver kromatografisk top i den ukendte prøve.Den kromatografiske kvalitative metode er at sammenligne retentionstiden med standardprøven.Kriteriet Utilstrækkeligtyderligere bekræftelse (kvalitativ)

1. Standard additionsmetode

2. Brug andre metoder på samme tid: andre kromatografiske metoder (ændre mekanismen, såsom: brug af forskellige kromatografiske kolonner), andre detektorer (PDA: spektrumsammenligning, spektrumbibliotekssøgning; MS: massespektrumanalyse, spektrumbibliotekssøgning)

3. Andre instrumenter og metoder

EN DEL
06 Bekræftelse af kvantitativ topkonsistens

Bekræft kromatografisk topkonsistens (renhed)

Sørg for, at der kun er én målt komponent under hver kromatografisk top

Tjek for interferens fra co-eluerende stoffer (urenheder)

Metoder til bekræftelse af kromatografisk topkonsistens (renhed)

Sammenligning af spektrogrammer med Photodiode Matrix (PDA) detektorer

Identifikation af maksimal renhed

2996 Renhedsvinkelteori

Kvantitative metoder, der almindeligvis anvendes i DEL 07

Standardkurvemetode, opdelt i ekstern standardmetode og intern standardmetode:

1. Ekstern standardmetode: mest brugt i væskekromatografi

En række standardprøver med kendte koncentrationer blev fremstillet under anvendelse af rene prøver af forbindelserne, der skulle testes som standardprøver.injiceres i kolonnen op til dens responsværdi (peak area).
Inden for et vist interval er der en god lineær sammenhæng mellem standardprøvens koncentration og responsværdien, nemlig W= f×A , og der laves en standardkurve.

Under nøjagtig de samme eksperimentelle betingelser injiceres den ukendte prøve for at opnå responsværdien for den komponent, der skal måles.Ifølge den kendte koefficient f kan koncentrationen af ​​den komponent, der skal måles, opnås.

Fordelene ved den eksterne standardmetode:enkel betjening og beregning, det er en almindeligt anvendt kvantitativ metode;intet behov for, at hver komponent detekteres og elueres;standardprøve er påkrævet;målebetingelserne for standardprøven og ukendt prøve bør være konsistente;injektionsvolumenet skal være præcist.

Ulemper ved den eksterne standardmetode:De eksperimentelle betingelser skal være høje, såsom detektorens følsomhed, flowhastigheden og sammensætningen af ​​den mobile fase kan ikke ændres;volumenet af hver injektion skal have god repeterbarhed.

2. Intern standardmetode: nøjagtig, men besværlig, mest brugt i standardmetoder

En kendt mængde af den interne standard tilsættes standarden for at lave en blandet standard, og en række arbejdsstandarder med kendt koncentration fremstilles.Molforholdet mellem standard og intern standard i den blandede standard forbliver uændret.Injicer i den kromatografiske søjle, og tag (standardprøvespidsareal/intern standardprøvespidsareal) som responsværdi.Ifølge den lineære sammenhæng mellem responsværdien og koncentrationen af ​​arbejdsstandarden, nemlig W= f×A , laves en standardkurve.

En kendt mængde intern standard tilsættes til den ukendte prøve og injiceres i kolonnen for at opnå responsværdien for den komponent, der skal måles.Ifølge den kendte koefficient f kan koncentrationen af ​​den komponent, der skal måles, opnås.

Den interne standardmetodes egenskaber:Under operationen blandes prøven og den interne standard sammen og injiceres i den kromatografiske søjle, så længe forholdet mellem mængden af ​​den målte komponent og den interne standard i den blandede opløsning er konstant, ændres prøvevolumenet vil ikke påvirke de kvantitative resultater..Den interne standardmetode opvejer indflydelsen af ​​prøvevolumenet og endda den mobile fase og detektor, så den er mere nøjagtig end den eksterne standardmetode.

EN DEL
08 Faktorer, der påvirker kvantitative analyseresultater

Dårlig nøjagtighed kan skyldes:

Forkert spidsarealintegration, prøvenedbrydning eller urenheder introduceret under prøveforberedelse, prøvehætteglas ikke forseglet, prøve- eller opløsningsmiddelfordampning, forkert prøveforberedelse, prøveinjektionsproblemer, forkert intern standardforberedelse

Mulige årsager til dårlig præcision:

Forkert topintegration, injektions- eller injektorproblemer, prøvenedbrydning eller urenheder introduceret under prøveforberedelse, kromatografiske problemer, forringet detektorrespons